Non esistono documenti che attestino la paternità del progetto dell'Horto medicinale, mentre è documentato il coinvolgimento nei lavori di esecuzione dell'architetto bergamasco Andrea Moroni.
La forma trapezoidale del terreno a disposizione condizionò la pianta dell'Orto. Fu creata una struttura circolare con un quadrato inscritto, suddiviso in quattro quadrati più piccoli da due viali perpendicolari. I quattro quadrati, detti "quarti" o anche "spalti" perché originariamente sopraelevati di circa 70 cm rispetto ai viali, erano suddivisidi in aiuole ("areole") disposte in modo da formare eleganti disegni geometrici, diversi uno dall'altro. Pochi anni dopo la fondazione, nel 1552, fu costruito un muro circolare di recinzione, per impedire i continui furti notturni delle preziose piante medicinali coltivate nell'Orto.
La struttura architettonica dell'Orto subì in tempi successivi modifiche e arricchimenti, che però non alterarono in modo sostanziale il disegno originario.
All'inizio del Settecento vennero realizzati i quattro monumentali portali d'ingresso dell'Hortus cinctus, con stipiti in trachite sormontati da vasi in pietra (acroteri) contenenti piante in ferro battuto, e provvisti di eleganti cancelli, anch'essi in ferro battuto.
Venne eliminato il dislivello tra i viali e gli "spalti" e modificato il disegno delle aiuole; furono inserite una fontana al centro di ciascun quarto e una all'incrocio dei due viali principali. Il muro circolare fu ingentilito, nella prima metà del Settecento, da una balaustra con eleganti colonnine in pietra bianca, su cui furono collocati vasi e busti di importanti personaggi, rivolti verso il centro dell'Orto.